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作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所，中国科学院大学
出版期刊：Nature Reviews Molecular Cell Biology
当年IF：IF2019=55.470
Online时间：2020.9.24
DOI：10.1038/s41580-020-00288-9

摘要：源于原核生物的CRISPR-Cas基因组编辑技术对植物分子生物学的改变超出了人们的预期。CRISPR-Cas 具有稳健性、高目标特异性和可编程性等特点，可对作物进行精准的遗传操作，从而有机会创造出具有益性状的种质，并开发出新型的、更可持续的农业系统。此外，基于CRISPR-Cas平台的众多新兴生物技术也扩大了基础研究和植物合成生物学的工具箱。在本综述中，利来·国际APP首先简要介绍了CRISPR-Cas的基因编辑技术，重点是最新的精准基因编辑技术，如碱基编辑和质粒编辑。然后，利来·国际APP将讨论CRISPR-Cas在提高植物产量、质量、抗病性和抗除草剂性、育种和加速驯化方面的最重要应用。利来·国际APP还重点介绍了CRISPR-Cas相关植物生物技术的最新突破，包括CRISPR-Cas试剂递送、基因调控、多重基因编辑和诱变及定向进化技术。最后，利来·国际APP讨论了这一改变游戏规则的技术应用前景。

引言

全球农业生产正面临前所未有的挑战。到 2050 年，世界人口将达到 96 亿，对主要作物的需求将增加 60%¹。由于绿色革命带来的增产速度持续下降，而不利的气候变化预计将进一步限制植物生产，因此需要培育出对不利环境有更强适应能力、能提高产量改善品质的栽培品种。然而，用于作物育种的传统策略费力、费时、复杂，需要更有效、更省时的育种方法²。

随着测序技术的飞速发展，越来越多的植物物种的基因组信息可供使用，基因组编辑系统提供了精准编辑基因的机会，为作物改良创造了新的机遇。基因组编辑的基本策略是使用序列特异性核酸酶在目标位点诱导 DNA 双链断裂（DSB）。此后，依赖于供体的同源定向修复（HDR）途径或容易出错的非同源末端连接途径都会修复 DSB 并引入某种基因变化。早期的序列特异性核酸酶，包括巨核酸酶³、锌指核酸酶⁴和转录激活剂样效应核酸酶⁵，已被证明可有效用于植物基因组编辑，但它们的构建需要复杂的蛋白质工程，这限制了它们的适用性。

CRISPR（簇状的、有规律间隔的、短回文重复序列）-Cas（CRISPR相关蛋白）是古生菌和细菌的一种适应性噬菌体免疫系统。由于CRISPR-Cas9和其他 CRISPR-Cas 系统依靠 DNA-RNA 识别和结合来进行序列特异性核酸切割，因此可以很容易地进行编程，以最低的成本在任何所需的靶位点引入DSB⁶。自 2013 年首次应用于植物^7-9以来，CRISPR-Cas 已被用于多种作物的基因组编辑，为其中许多物种引入了极具价值的农业性状¹⁰。特别是新开发的精准CRISPR-Cas技术，由于能诱导精确的核苷酸变化，有望对农业产生重大影响。然而，CRISPR-Cas 的功能远不止编辑特定基因座来改良作物。以这一改变游戏规则的多功能平台为基础，一些新型植物生物技术已经出现，它们能够促进基因调控和蛋白质工程。这些技术已经对基础生物学研究产生了影响，并带来了广泛应用的前景。

在本综述中，利来·国际APP首先介绍了基于CRISPR-Cas精准基因组编辑分子平台。然后，利来·国际APP讨论了 CRISPR-Cas 在作物改良、农业育种和野生物种驯化方面的最新应用。利来·国际APP还讨论了几种与CRISPR-Cas相关的植物生物技术，包括新型传递方法、基因表达调控、多重和高通量基因编辑以及原位定向进化。利来·国际APP的目的是全面总结CRISPR-Cas技术在植物中的发展，并展望未来的应用前景。

Table 1. 植物中精准基因编辑技术的特征

ABE，腺嘌呤碱基编辑器；AFID，APOBEC-Cas9 融合诱导删除系统；APOBEC3Bctd，APOBEC3B 的羧基末端催化结构域；CBE，胞嘧啶碱基编辑器碱基编辑器；CaMV，花椰菜花叶病毒；dCas9，无催化活性的 Cas9；ecTadA，大肠杆菌 tRNA 特异性腺苷脱氨酶；ecTadA*，大肠杆菌 tRNA 特异性腺苷脱氨酶变体；M-MLV，莫罗尼小鼠白血病病毒；NA，不可用；nCas9，Cas9 切分酶；STEME，饱和定向内源突变编辑器；UGI，UGI 编辑器。产品纯度根据所需编辑产品的比例进行评估。

Figure 1. 脱氨酶介导和反转录酶介导的植物精准基因组编辑技术。

(a) 植物碱基编辑技术。碱基编辑器由 Cas9 nickase（nCas9；带有D10A突变）与两种蛋白质融合而成：脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）可生成胞嘧啶碱基编辑器（CBE）产生 C:G>T:A 碱基置换，而腺嘌呤碱基编辑器（ABE）产生 A:T>G:C 碱基置换。nCas9 与这两种碱基编辑器的融合被称为 "饱和定向内源突变编辑器"（STEME 编辑器"（STEME），利用单个引导 RNA（sgRNA）同时产生 C:G>T:A 和 A:T>G:C 双碱基置换。

(b) APOBEC-Cas9 融合诱导删除系统（AFID）。胞苷脱氨酶将胞苷转化为尿苷，然后与胞苷脱氨酶-Cas9 复合物融合的尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）切除尿苷并生成一个嘧啶（AP）位点，该位点被单独但共同表达的 AP 裂解酶切分。碱基切除修复后，Cas9 诱导的 DNA 双链断裂位点与脱氨基胞苷之间会产生精确的缺失。

(c) 质粒编辑技术。质粒编辑工具由 nCas9 与反转录酶和质粒编辑引导 RNA（pegRNA）融合而成。pegRNA 在反转录酶模板的 3′端携带所需的突变（绿色标记）。引物结合位点（PBS）与nicked DNA链结合，从而将模板反转录为所需的 DNA 序列。编辑后的核苷酸会以精确的方式插入目标位点。PAM，原间隔邻接基序。

Figure 2. CRISPR-Cas9在育种技术中的应用

(a) 单倍体诱导。对MATRILINEAL（MTL）和DMP等基因进行CRISPR-Cas9编辑可产生单倍体诱导系，从而缩短稳定遗传背景所需的时间。

(b) 诱导有丝分裂以固定杂种活力。有丝分裂代替减数分裂（MiMe）基因型的植物可以通过在卵细胞中异位表达 BABY BOOM 1 (BBM1) 并引发孤雌生殖，或通过破坏MTL并导致父本基因组的消除，产生二倍体配子。

(c) 通过CRISPR-Cas在预定位点触发同源定向修复或染色体易位，以巩固有益的等位基因或打破不良的遗传连接。HR，同源重组。

Box 1. 不使用外源 DNA 的植物基因组编辑

不使用外源 DNA 的植物基因组编辑优于传统的基因组编辑，因为它产生的脱靶突变较少，并减少了法定监管问题。虽然基因组整合的外源序列可以通过杂交消除，但未检测到的载体片段可能会残留在基因组中，而且杂交对于无性繁殖的物种来说并不现实。一些使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白或 mRNA 的出色研究表明，基因编辑可以在水稻¹¹、莴苣¹¹和小麦^12-13中以无 DNA 的方式进行。然而，由于无 DNA 基因组编辑的效率低，且与引入外源选择标记不兼容，因此阻碍了无 DNA 基因组编辑的推广。解决这些问题的方法之一是创建内源可选择标记。由于除草剂靶向基因（如乙酰乳酸合成酶（ALS）基因）中的某些氨基酸取代可赋予其对除草剂的耐受性，因此用单导 RNA 共同靶向感兴趣的基因和 ALS，并选择除草剂抗性，可极大地丰富具有所需编辑的感兴趣基因的植物^14-15。如果每种成分都以 RNA 或蛋白质形式传递，这种可选择的联合编辑策略可促进无 DNA 编辑。促进无 DNA 基因编辑的另一种方法是使用形态发生调节剂（Box 2），通过与无 DNA CRISPR-Cas试剂一起传递来提高编辑效率，因为形态发生调节剂可以促进转化体的再生^16-1⁷。随着未来的发展，无DNA编辑可能会成为植物基因组编辑的主要方法。

Figure 3. CRISPR-Cas系统的递送策略

(a) 将CRISPR-Cas试剂送入植物细胞。编码 CRISPR-Cas 试剂（Cas 和单导 RNA（sgRNA））或 CRISPR-Cas-sgRNA 核糖核蛋白（RNP）的 DNA 或 RNA 可通过农杆菌、纳米粒子和生物轰击等方法送入植物细胞，这些方法都能穿过坚硬的细胞壁。聚乙二醇（PEG）可以介导植物原生质体的转化。可将编码 CRISPR-Cas 试剂的 DNA 或 RNA 导入植物病毒的基因组，病毒感染植物细胞，在细胞内复制，并通过质粒转移到其他细胞。叶绿体靶向递送可通过生物轰击和纳米粒子来实现。

(b) 通过从头诱导分生组织进行基因编辑。首先移除 Cas9 基因表达植株的分生组织，然后将含有形态发生调节因子（MR）和 sgRNA 的农杆菌培养物注入修剪位点。形态发生调节剂可以诱导形成新的基因编辑分生组织，并从新生成的芽中收获基因编辑植物。

(c) 利用植物 RNA 病毒诱导可遗传的基因组编辑。将融合了 RNA 移动元件的 sgRNA 导入烟草鼠疫病毒（TRV）RNA2。经农杆菌介导渗入 Cas9 基因表达植物后，sgRNA 可通过移动元件在植物体内系统传播，从而引入可遗传的诱变。

(d) 通过单倍体诱导系传递 CRISPR-Cas。表达CRISPR-Cas的单倍体诱导系为具有转化能力的植物授粉。受精后，进行基因编辑，消除父系基因组中携带MATRILINEAL（MTL）基因突变的基因，从而产生优良的遗传背景。通过染色体加倍可以产生同源突变株。

Box 2. 利用形态发生调节剂促进再生

再生是获得CRISPR-Cas编辑植物的一个不可避免的核心步骤。然而，目前的再生系统主要依赖组织培养，费时费力，而且依赖物种和基因型。由于再生已成为在植物中应用CRISPR-Cas的障碍，形态发生调节剂已成为应对这一挑战的有前途的工具。形态发生调节因子是一组转录因子，它们与植物激素一起在分生组织的决定和维持方面发挥作用并能诱导分生组织形态发生和产生胚状结构。在玉米外植体中同时过表达编码两种形态发生调节因BABY BOOM 1 (BBM1)和WUS2的基因，可诱导近交系和不易转化的组织再生出转基因植株¹⁸。由于形态发生调节因子高度保守，这种方法很容易推广到其他不可再生的基因型或作物上，如水稻、甘蔗和大豆¹⁵^{, 18-19}。利用形态发生调节因子，在将CRISPR-Cas和BBM1及WUS2一起送入植物细胞后，成功地再生出了经过基因编辑的难育玉米近交系植株²⁰。然而，由于BBM和WUS2的组成型表达可能导致发育异常和不育，因此亟需使用其他形态发生调节因子的新工具。

Figure 4. 多重基因组编辑策略

(a) 使用一种 Cas 蛋白和多个单导RNA（sgRNA）进行多重基因组编辑。两个 sgRNA（靶向Cas9）或CRISPR RNA（crRNA；靶向 Cas12a）可同时用于靶向两个（或多个）不同位点（T1和T2）。

(b) 多重正交基因组编辑策略使用催化不活跃的Cas9（dCas9）和不同的 sgRNA 支架（scRNA）。例如，scRNA1和scRNA2含有不同的RNA合体，可以招募不同的效应蛋白，如调节转录的蛋白或荧光蛋白。

(c) 一种多重正交基因组编辑策略，使用一种Cas蛋白和两种sgRNA或crRNA，其中一种带有全长的原核载体，另一种带有截短的原核载体。全长 sgRNA-T1 或crRNA-T1 以基因1为目标，由相应的Cas蛋白进行删除。截短的原空间介质（tsgRNA-T2或tcrRNA-T2）不支持Cas的全部催化活性，但能使Cas调节基因 2 的表达。

(d) 用Cas的同源物进行多重正交基因组编辑。使用正交sgRNA和/或crRNA 支架（未显示）的Cas9和/或Cas12a的同源物可用于多重正交编辑。效应物可以是脱氨酶或基因表达调节剂。不过，在某些情况下可能不需要效应物，例如创建基因敲除。

(e) 由单一系统（SWISS）诱导的同步广泛编辑。MS2的RNA aptamer 用于招募胞苷脱氨酶模块，boxB用于招募腺苷脱氨酶模块，成对的sgRNA 用于创建插入和缺失。boxB，招募 N22p 的 RNA aptamer 发夹；CBE，胞嘧啶碱基编辑器；ecTadA、ecTadA*，ecTadA变体；esgRNA，增强sgRNA；UGI，尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂；MCP，MS2 外壳蛋白；MS2，噬菌体 MS2的RNA aptamer；N22p，亲和力增强的噬菌体-λ N肽。

Figure 5. 利用基于 CRISPR-Cas 的技术定向进化抗除草剂基因

(a) 基于CRISPR-Cas9技术的剪接因子3B亚基1（SF3B1）基因在黑麦草中的定向进化，以提高对剪接抑制剂herboxidiene的抗性。

(b) 利用饱和定向内源诱变编辑器（STEME）双碱基编辑器对O. sativa乙酰辅酶A羧化酶2（ACC2）基因进行定向进化，提高水稻的抗除草剂性。PAM，原间隔邻接基序；sgRNA，单导 RNA；WT，野生型。

结论与展望

CRISPR-Cas已成为改变植物基础研究和应用研究游戏规则的工具。除了 CRISPR-Cas核酸酶诱导的indel突变外，人们还设计了一系列CRISPR-Cas衍生的编辑器，可以对基因组进行精确操作。这些工具具有无与伦比的基因编辑能力，帮助创造了数以百计的农作物品种，提高了农艺性能，并彻底改变了育种技术。

CRISPR-Cas为在短时间内驯化孤儿作物或野生物种以促进全球粮食安全和消除贫困带来了可能性。与CRISPR-Cas相关的许多植物生物技术也得到了开发或更新，包括促进植物基因编辑的传递方法；在不同表达阶段进行精准基因调控的方法；以及实现多位点基因组编辑、功能基因组学screening和植物定向进化的多重和高通量基因编辑方法。

然而，这些多功能工具还不能满足植物基因组操作的所有需求，进一步开发对 CRISPR-Cas在植物中的应用至关重要。由于某些农业性状是多个数量性状位点的产物，编辑单个基因可能不会产生足够的表型变化，因此开发高效的 CRISPR-Cas介导的定向插入和染色体组重排技术，以组合或"堆叠"突变等位基因将是非常有利的。由于破坏特定基因可能会带来适应性损失，因此需要在调控基因表达和精准基因组编辑方面取得进一步进展，以高效、有针对性地微调基因功能。此外，由于将某些外源蛋白质直接转化到植物中可能存在问题，因此完善CRISPR-Cas衍生的定向进化平台，使其更适合植物系统将大有裨益。由于CRISPR-Cas试剂的递送仍是植物基因组编辑的主要障碍，因此开发更多新型递送方法是可取的；纳米材料（如碳纳米管^21-22、DNA纳米结构²³和细胞穿膜肽²⁴）是以各种形式递送CRISPR-Cas有前途的载体，因为它们可以在没有机械辅助的情况下扩散到有壁的植物细胞中，且不会造成组织损伤。基础基因研究也亟需取得进展，以确定与特定理想农艺性状相关的基因。

除上述应用外，CRISPR-Cas 还可能被重新用于新的应用领域，如编辑线粒体和叶绿体的基因组、追踪细胞系以阐明植物发育的基本模式、构建遗传电路以整合和传递信号、开发植物生物传感器以检测内部和外部信号，以及植物合成生物学的其他应用。总之，CRISPR-Cas技术无疑已经并将继续彻底改变农业和植物生物技术。

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文章来源：原本随想