简介
细胞凋亡——或程序性细胞死亡——是许多生物学过程的核心组成部分，包括发育、组织稳态、免疫系统的成熟和维持。因此，识别与区分凋亡细胞、死细胞和活细胞，在众多生物学研究领域中显得非常重要。
荧光激活细胞分选（FACS）是区分凋亡细胞、坏死细胞和活细胞最常用且成熟的方法之一。然而，它需要对大量胰蛋白酶消化细胞进行分析，并且通常需要针对多个微孔板进行不同时间点或不同模式的检测。
在健康细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧。在细胞凋亡的早期，PS外翻是细胞被吞噬的标志信号。一旦PS翻转到细胞膜外侧，可被与荧光标记（如异硫氰酸荧光素（FITC）或Alexa Fluor®488）结合的钙依赖性磷脂结合蛋白annexin V检测到。添加第二种不渗透细胞的染料，如碘化丙啶（PI），可以区分坏死细胞，PI能够透过死细胞的细胞膜而使细胞核染色。PI和FITC/Alexa Fluor 488联合使用是区分细胞培养中凋亡和坏死的标准流程。在这种情况下，早期凋亡细胞为annexin V探针信号较强和PI的荧光信号较弱或观察不到荧光信号，而晚期凋亡细胞为annexin V和PI双探针均呈现较强的荧光信号，如图1所示。细胞总数可以通过核染色确定，如Hoechst 33342或DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）等细胞核探针。
Spark Cyto全自动实时活细胞检测系统将酶标仪的多功能检测能力与精密的成像功能巧妙的整合在一起，可直接在微孔板中对细胞样本进行明场和荧光成像检测。与此同时，功能强大且易用的SparkControl™ 软件能够提供大量的预定义程序，极大简化了基于细胞的常见检测分析过程。
本文通过使用细胞死亡应用程序，用于评估A431人鳞状上皮癌细胞经细胞毒性剂处理后的细胞死亡情况。检测过程中，使用了SparkCyto的荧光成像模块对PI、annexinV、Hoechest 33342进行了荧光成像拍摄。
材料和方法
细胞培养
A431 细胞 (ATCC® No. CRL-1555) 在37°C和5% CO2的潮湿条件下，在DMEM高糖生长培养基（Sigma）中生长至约70-80%的细胞密度，该培养基补充有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、HEPES和5%热灭活胎牛血清（FCS、PAA实验室）。然后收集细胞，计数并接种到底部透明的96孔黑色组织培养板（Tecan，3012306）中。在200ul培养基中，每孔的密度为7500个细胞。将培养板过夜培养，使细胞贴壁。
诱导凋亡
星孢菌素是一种有效的凋亡诱导剂[1]，使用两种不同浓度的星孢菌素（#S5921，Sigma-Aldrich）诱导细胞凋亡。简而言之，从孔中吸取培养基，添加含有0、1、2μM 星孢菌素的新鲜培养基，细胞在37°C和5% CO2条件下培养6小时。吸取含有星孢菌素的培养基，在进行染色步骤之前，用PBS清洗细胞两次。
染色方法
根据说明书，将Alexa Fluor488标记了的Annexin V（#13201，Thermo Scienti‑c）与PI结合使用，以区分细胞膜破裂的细胞。用Hoechst 33342溶液（#62249，ThermoScienti‑c）对细胞进行染色，以识别单个细胞核。
染色溶液由以下成分组成：
• 97 μl 1X 结合液
• 1 μl annexin V-Alexa Fluor 488
• 1 μl PI (0.1 mg/ml stock)
• 1 μl Hoechst 33342 (1 mg/ml stock)
将染色溶液添加到所有实验孔中，并在光保护条件下培养15分钟。未经处理的对照组和仅用annexin V或PI染色的对照孔，用于信号串色校正。
每个细胞系的特定荧光图谱可能存在不同，应分别进行优化和建立。此外，应针对每个细胞系和细胞毒性剂优化最佳染色条件和分析时间。
图像采集与分析
本实验采用SparkControl软件荧光成像的预定义细胞死亡应用程序进行实验。使用10倍物镜，拍摄每个孔蓝色、绿色和红色荧光通道的孔中心图像。仪器的参数设置见表1。使用单独染色的对照孔进行串色校正。
与所有预定义的SparkControl应用一样，分析步骤也是预定义的，可以通过以下参数识别并量化研究对象：
• 带有绿色或红色信号的蓝色对象（%）（即带有蓝色和绿色或蓝色和红色荧光对象的百分比）
• 带有绿色信号的蓝色对象
• 带有红色信号的蓝色对象
• 带有绿色和红色信号的蓝色对象
• 没有绿色或红色信号的蓝色对象
结果
Spark Cyto的图像采集结果显示，根据细胞核的Hoechst染色情况，可以清晰地对A431细胞进行区分。此外，经星孢菌素处理的annexin V-Alexa Fluor 488（绿色）和PI荧光（红色）均呈阳性，这表明诱导了细胞凋亡（如图2所示）。
细胞死亡应用分析程序是基于所有三种荧光信号的邻近相关（共定位）效应，它能够帮助识别和区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。SparkControl软件能够独特地识别以下对象：
• 蓝色对象 – 细胞核
• 蓝色/绿色对象 – 早期凋亡细胞
• 蓝色/红色细胞 – 坏死细胞
• 蓝色/红色/绿色对象 – 晚期凋亡细胞
这使得用户可以从数据中获得最大的信息量，以便更恰当地解释实验结果。
A431细胞经过添加1μM星孢菌素处理后，可导致约50%细胞死亡。而对于使用2μM星孢菌素处理的细胞样本，结果显示其死亡率进一步增加（图3）。
即使在没有诱导细胞死亡的情况下，一定数量的细胞可能会对不同标记物呈阳性。由于所选细胞系的不同及细胞聚集效应，细胞凋亡的基线水平会存在很大差异。因此，通过研究未经处理的对照细胞（无化合物介导的细胞死亡诱导）来确定这些基线水平显得非常重要。
结论
Spark Cyto的荧光成像功能非常适用于各类细胞检测分析。SparkControl软件中的细胞死亡应用程序，可以有效简化针对使用常用染料染色的凋亡细胞和坏死细胞的检测分析过程。
此外，该系统能够提供全面的环境控制，包括温度、气体和湿度等，以确保细胞样本在整个分析期间都处于理想状态。
参考文献
1) Oberdanner et al. Glucose is required to maintain highATP-levels for the energy-utilizing steps during PDTinducedapoptosis. Photochem Photobiol, 2002; 76(6),695-703.
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