简介
监测原核细胞和酵母的生长是生命科学以及食品工业中的重要研究工具。比浊法是一种对细菌和酵母菌进行定量测量的成熟方法。该技术基于这样一个事实，即溶液的浊度与其所含的微生物数量成正比，并且随着细胞生长而增加。使用分光光度计则可以轻松测量浊度，通过样品的光会被微生物散射。细胞中含有许多吸收光的大分子，例如 260 nm的DNA、280 nm的蛋白质、400至500 nm之间的细胞色素和其他各细胞色素。当通过光散射测量细菌和酵母菌时，最好选择吸收率最低的波长；建议波长为600nm，而且它适用于大多数的培养物。在此波长下，样品的光密度（OD）与存在的细胞数量直接成正比，因此此方法便可以作为跟踪细胞生长的一种方法。只有通过生成相应的标准曲线，才能够实现于 600 nm 处的吸光度精确测量从而得到细胞数量。
Tecan的新一代多功能酶标仪Spark和Spark Cyto，以及Tecan产品组合中的其他酶标仪（如Infinite® 200 PRO系列）已成功地应用于分析细菌和酵母生长的各种研究。显然，使用微孔板而不是比色皿来监测细胞生长的最显著的益处是更高的通量。高端酶标仪的其他优点是：具备微孔板振荡功能以、温度控制及培养功能，且坚固耐用。这就意味着不需要把微孔板从培养箱转移到分光光度计，从而可以在酶标仪内进行长时间的动力学研究，而无需手动中断，并自动地消除了结果数据图中的过夜间隙。
此外，Spark酶标仪还为细菌生长研究提供了有价值的特色功能，例如集成的微孔板架Lid Lifter™，最大程度地减少介质挥发的湿度匣，用于将温度精确控制在18至42°C区间内的Te-Cool™冷却模块，以及用于实现4倍物镜明场成像的成像模块。
Spark Cyto在很大程度上结合了与Spark相同的功能（Te-Cool™兼容性除外），并具有先进成像模块的附加优势，可提供三种不同分辨率的明场和荧光成像功能。
本技术说明展示了 Spark 酶标仪适用于在常用的24孔板和96孔]板上为三种不同的细菌菌株生成生长曲线：
大肠杆菌 (E. coli) 是大肠杆菌属的一种革兰氏阴性、兼性厌氧、杆状、大肠菌群、鞭毛状细菌，常见于热血生物的下肠。多数大肠杆菌菌株是无害的，但是具有肠致病性(EPEC)、肠毒素原性(ETEC)等类型可在其宿主体内引起严重的食物中毒，偶尔见于食品污染事件。大肠杆菌是生命科学和生物技术研究开发中最重要的菌种。
英诺克李斯特菌，又称无害李斯特菌 (L. innocua) 是一种革兰氏阳性的杆状细菌。它是可移动的，兼性厌氧的，非孢子形成的。英诺克李斯特菌之所以被命名为英诺克（无害），是因为相对于单增李斯特菌，它在哺乳动物中并不容易引起疾病。英诺克李斯特菌通常被用作单增李斯特菌的替代品。
头葡萄球菌 (S. capitis) 是葡萄球菌属的一种凝固酶为阴性的细菌。它是人类头皮、脸部、颈部、阴囊和耳朵皮肤正常菌群的一部分，与人工瓣膜心内膜炎有关，但很少与自然瓣膜感染有关。头葡萄球菌通常用作金黄色葡萄球菌的替代品。
文章描述了上述三种细菌菌株在24孔和96孔板中，8小时内生成OD 600生长曲线的既定方法。重要仪器设置（如振荡）带来的影响，也需要考虑进来。
材料和方法
• Spark多功能酶标仪
• 大肠杆菌（ATCC 25922）， 肉蛋白胨培养基 （MPM）
• 英诺克李斯特菌（ATCC 33090）， 脑心浸液 （BHI）
• 头葡萄球菌 （ATCC 27840），胰蛋白酶大豆酵母提取物（TSYE）
• Greiner® Cellstar 24孔及96孔板，平底、透明 (24孔板#662102，96孔板#655185
细菌菌株在20 ml推荐的生长培养基中进行有氧环境下的培养。在MaxQ™ 4450台式轨道振荡器（Thermo Fisher）上以37 °C / 分钟200转速孵育过夜后，将液体悬浮液稀释至600 nm处约0.05 OD的吸光度。为了使程序标准化，为24孔及96孔板分别选择了最大工作体积：96孔板为200微升、24孔板为1200 μl。这样使得所有细菌细胞获取到最多的培养基成分，以及取得最佳的混匀效果。此外，使用最大工作体积可在指定的微孔板中实现最长的吸光度测量路径长度，从而提高 OD 600 测量的准确性和可重复性。 此外，还以最大单孔容积的50%（即600 μl /孔）估算了24孔板。
使用Para‑lm为微孔板加盖，并将盖子固定在微孔板上；另一种方法是使用微孔板密封膜。若使用微孔板密封膜固定盖子，微孔板振荡期间将导致塑料磨损，这可能会对信号检测和细胞增殖造成干扰。然后将微孔板在Spark多模酶标仪中孵育8小时，使用以下所列的模式和参数进行连续振荡和温度控制：
初步测试显示，只有在轨道振荡模式下才能产生可接受的生长曲线（数据未显示）。然而，考虑到可能会产生可接受的生长曲线，对其他微生物使用线性和双轨道振荡模式的做法不应被排除。
结果及讨论
图1至3显示了96孔板中三种细菌菌株的生长曲线。1mm的振荡幅度提供了最可行的振荡频率，是适用于三种细菌菌株的最佳设置。对于大肠杆菌，1 mm的振荡幅度对于取得可观的细菌生长至关重要（图1）。
对于头葡萄球菌（图2）和英诺克李斯特菌（图3），效果虽没有那么显著但仍然可见当使用 3 mm 和 6 mm 振荡幅度时，生长动态显著不同。当考虑这些不同细菌菌株的形状和形态时，很明显，大肠杆菌作为一种鞭毛状细菌，需要使用最大的振荡强度以避免在孵育过程中的细菌聚集现象。只有使用Spark酶标仪提供的最低振动幅度才能实现。
从图4可以看出，以最大培养基容积培养的 24 孔板的振荡幅度及相应结果。通常，3 mm 和 6 mm 的较大振荡幅度会产生更高质量的生长曲线。使用 3 mm 和 6 mm 振荡幅度的样品在接种后仅 1 小时便开始对数生长，并在 5 小时后到达平台期；而振荡幅度为 1 mm 的样品生长曲线延迟上扬，并在大约 8 小时后才能到达平台期。总体而言，24 孔板上振荡幅度带来的影响不如具有较小孔径的 96 孔板显著。
在24孔板中最大工作体积为 1200 μl 的培养基所对应的生长曲线结果偶尔会因样品液体溢出到微孔板盖上而受到影响。为避免这种情况，利来·国际APP建议最大工作体积不要用于6至 48 孔板。通过使用 600 μl 培养基在 24 孔板中生成的生长曲线来测试较小工作体积带来的影响，例如最大工作体积的 50%（如图5所示）。同样地，与 1 mm 振荡幅度相比，3mm 和 6 mm 振荡幅度也能产生更好的生长曲线。然而，与1200 μl 培养基对比，生长曲线似乎与振荡幅度相关性较小，如先前观察到的 1 mm 振幅下的延迟生长（如图4所示）较不显著（如图5所示）。
降低微孔板的孔中样品体积时的另一个考虑因素是，OD 600 吸光度测量的光程长度也减小，从而导致整体上最大 OD 值降低、动态测量范围减小。从图6中能够很清楚地看出这种效应，该图显示了分别处于 600 μl 和 1200 μl 体积的 24 孔板中培育的大肠杆菌生长情况。有趣的是，虽然将体系体积降低到 600 μl 会导致动态测量范围减小，但它使得培育动态得到改善，相比 1200 μl 体积的细胞，其生长速率约提前1小时达到停滞状态。这可以通过大肠杆菌的形态来解释：较少的体积可以在 24 孔板中得到更好的混合，从而增强培养基中细胞的生长。
这些结果表明：细菌生长取决于许多不同的因素，包括细菌菌株、微孔板的类型和形式、培养基反应体积以及至关重要的仪器参数设置（例如振荡模式和其振幅）。
总结
监测细菌和酵母的生长是生命科学和食品工业中重要的研究工具。Tecan的产品，尤其是其酶标仪，在该研究领域久经考验，并提供创新的功能来支持客户的多样化需求。本技术说明展示了Spark多模式酶标仪在为大肠杆菌 (E.coli)、英诺克李斯特菌 (L. innocua)、及头葡萄球菌 (S.capitis)在24孔板及96孔板上生成生长曲线的出色性能。此外，这项研究清晰地强调了初步优化实验的重要性，数据质量主要取决于振荡幅度参数。
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