简介
细胞迁移是多细胞生物发育和维持的核心过程，胚胎发育过程中的组织形成、伤口愈合和免疫反应都需要细胞的协调运动和组装。细胞迁移过程中出现的异常情况与各种疾病有关——包括癌症、动脉粥样硬化和关节炎——因此，了解细胞迁移和触发细胞从一个位置迁移到另一个位置的生物事件是研究的重点。
在这种情况下，基于成像的分析方法是研究细胞迁移的非常有价值的工具。虽然使用视觉显微镜进行图像分析是细胞生物学中一种长期可靠的方法，但它非常耗时和费力。细胞样本的自动成像分析极大地改善了实验工作流程并提高了通量，同时最大限度地减少了由可变起始条件引起的实验间差异。基于实时成像的读数可用于在不间断长时间u对细胞生长和健康进行无人值守监测。
Tecan 的 Spark 仪器平台具有集成的明场细胞成像模块，可实现对微孔板孔中细胞汇合度的无标记实时评估。酶标仪能够检测 6 至 96 孔板的细胞覆盖区域，并根据分析区域计算相对汇合率。汇合率还可用于将其他细胞相关信号（例如细胞 ATP 含量）标准化为样本中的细胞数量。 Spark的汇合成像功能允许研究各种不同形式的细胞迁移——例如趋化性、迁移和组织侵袭，以及肿瘤细胞转移。
Radius™ 96 孔细胞迁移检测是一种所谓的“间隙闭合”检测系统，它使用定义的无细胞区域，可以重新填充细胞并通过视觉或自动显微镜进行实时监测。
与只能在终点进行分析的 Boyden 室检测不同，Radius检测使用专有的细胞培养板，该培养板带有一个由生物相容性水凝胶（Radius 凝胶）在每个板孔的中心。当细胞在孔中接种时，它们会附着在除凝胶点之外的任何地方，从而产生无细胞区。细胞播种后，凝胶点被去除，允许迁移细胞穿过该区域并关闭间隙。细胞单层中的这种“人造伤口”可用于研究细胞迁移、细胞增殖和伤口闭合。由于间隙在板孔内有明确区域和位置，使得这种方法比传统的划痕检测显示更一致。
本文使用 Radius 96 孔细胞迁移分析试剂盒描述了 Spark多功能酶标仪的成像功能监测细胞迁移的应用。
此外，本文说明了细胞汇合度和细胞内 ATP 含量之间的相关性，作为细胞活力和新陈代谢的指标。
材料和方法
迁移
Radius 96 孔细胞迁移分析试剂盒（Cell Biolabs，CBA-126）与 Spark 多功能酶标仪的汇合成像功能结合，监测两种胆道癌细胞系（“CL1”和“CL2”） 30 小时内细胞迁移和增殖。CL1 具有可忽略的迁移特性，而 CL2 具有高迁移活性。将细胞在补充有L-谷氨酰胺(L-glutamine)、青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)、丙酮酸钠(sodiumpyruvate) 和 HEPES + 10% 胎牛血清 (FCS) 的 DMEM 高葡萄糖中培养。对于迁移实验，将细胞转移到不含 FCS 的培养基中以最大限度地减少细胞分裂，并且能够监测迁移活动。然后将细胞以 3x104 个细胞/孔的初始密度（预先确定最佳接种密度）接种到透明的 Radius 96 孔细胞迁移分析微孔板（随试剂盒提供）中，并培养过夜。在实验开始时移除Radius 板的插入物，并在 30 小时内监测迁移细胞对无细胞区域的再增殖情况。
在Spark上检测迁移以两种方式进行：手动和自动/动力学设置。
1.手动：实验期间将96板保存在传统的 CO2 培养箱中，并在 0、2、4、6、8、24 和 30 小时时转移到仪器中进行读数。
2.自动化：整个测量在 Spark 酶标仪内进行，在整个测量期间能够保持 5% CO2 和 37 °C，使用仪器的环境控制功能创建自动化工作流程。
在手动设置中，每次测量均在终点模式而不是动力学模式下进行。对于自动化/动力学设置，在 30 小时的整个实验期间记录汇合度，每 30 分钟有一个测量点。表 1 总结了自动/动力学细胞迁移实验的测量设置。汇合模式设置为“中央”，这意味着从每个板孔的中心拍摄并分析了一张中央图片。重要的是，“中央”模式仅在感兴趣区域（即无细胞点）位于孔的中间时才有用。测量/成像区域不能在孔内重新定位，检测到的汇合值仅反映分析点中细胞覆盖区域的百分比。然后根据图片计算的汇合值作为细胞迁移的反比指标进行评估，假设初始 (0h) 值代表 100% 无细胞区域。
汇合与细胞 ATP 含量的相关性
使用 CellTiter-Glo® 发光细胞活力试剂盒(Promega,G7571) 检测和量化细胞中的 ATP 水平。该方法是一种基于ATP 水平定量确定培养物中活细胞数量的均质方法，作为样品中存在代谢活性活细胞的指标 [2]。
同样，使用两种胆道癌细胞系（“CL3”和“CL4”）并以每孔初始细胞数范围（25000、12500、6750、3125）接种到 96 孔板中和 1563 个细胞/孔）。 24、30、48 和 50 小时后，使用“全孔”模式测量每个孔中的汇合度，然后立即在相同孔中进行 ATP 定量测定。通过计算发光/汇合比来评估结果，并根据 Grubbs 异常值检测测试识别和去除异常值。
结果
迁移模式
使用 Spark 酶标仪的汇合功能可以清楚地看到两种不同细胞系的预期迁移模式（图1）。虽然 CL1 没有或只有微不足道的迁移，但 CL2 在分析期间表现出无细胞区域的连续迁移和再增殖。
虽然在整个分析期间的迁移行为显示了手动和自动处理的相似动态，但后者的优点是不会由于操作人员的非工作时间而丢失数据点。因此，自动化处理提供了对细胞迁移动态一致且无间隙的分析。
在图 2 中可以清楚地看到无细胞区域的持续重新填充，并记录了填充的过程。在 30 小时分析期间，可以观察到超过一半的初始无细胞区域的再增殖，无细胞区域随着细胞迁移到圆圈中的增加而逐渐变小。在图 1 和图 2 中，假设初始值 (0 h) 代表 100% 无细胞区域。所有其他值均与初始情况相比较（另见表 2）。
通过 Spark Control™ 软件在选定测量区域检测到的逆汇合值来确定迁移程度，即孔中心的单张图片（图2）。为了准确确定间隙区域，推荐使用 ImageJ等第三方图像分析软件。
汇合度与细胞 ATP 含量的相关性
图3 显示了在细胞接种时使用不同的接种细胞数在 54小时内的汇合度和ATP生物发光之间的相关性。随着时间的推移，两种信号都表现出相似的动态，表明细胞的逐渐生长，其特征在于细胞 ATP 含量的增加和孔底细胞密度的增加。接种细胞数低于 3000 个细胞/孔时，汇合度超出推荐范围（<10%），因此建议使用更高的细胞数进行可靠的实验。当接种细胞数量高于3125 个/孔，可以观察到 ATP 信号和汇合度之间的良好相关性，表明可以使用汇合测量来标准化接种细胞数，而不需要额外通过检测 ATP 含量来确定细胞数。
结论
这项研究的结果表明，Spark 酶标仪平台非常适合检测细胞迁移和汇合度测定，例如 Radius 96 孔细胞迁移测定。该仪器基于明场成像的汇合功能，能够对细胞运动进行高质量和无标记的实时监测，从而量化和跟踪细胞迁移的动态。酶标仪的 SparkControl 软件可以轻松量化微孔板孔中的细胞汇合度，用户可进行模式选择，用于分析孔内的不同区域并自动检测任何类型微孔板的孔边界。
该平台拥有将汇合度与细胞 ATP 含量相关联的能力，通过无人值守的自动化实验，进一步简化了基于细胞的分析工作流程。由于汇合度检测是非标记定量技术，并且不会干扰任何其他细胞特性或性质，因此，它可以在整个实验期间连续进行，为更传统、昂贵且费时费力的技术提供了一种简单可靠的替代方法，非常适用于确定目标细胞群体的大小或质量。
参考文献
[1] Radius 96-Well Cell Migration Assay, Product Manual,CBA-126, Cell Biolabs Inc., San Diego, USA
[2]CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay,Technical Bulletin 288, 03/15, Promega, Madison,WI, USA
（文章来源：）
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