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| Western Blot一做就是一天半，有个方法帮你 3 小时搞定 |
| [ 发布日期：2023-5-8 13:36:16 阅读次数：555 ] |
Western Blot（WB）被称为科研人心中的「噩梦」实验，为什么这么说呢？首先，WB操作步骤繁杂，实验流程长。从蛋白提取、制胶、电泳、转膜、抗体孵育到成像，每个流程都相当耗时。特别是抗体孵育，还需要过夜。其次，WB实验结果受太多人为因素的影响。比如，制胶拔梳子太快，胶被弄裂；转膜「三明治」叠放顺序出错，导致转膜失败......最让人烦恼的一点，WB实验的重复性和稳定性不佳。学术新闻里常常能看到SCI 文章由于WB实验无法重复而撤稿。望着我的实验记录本，满满的失败数据和注意事项。眼看着离心管里来之不易的蛋白样本就要见底，难道真的没有更简单更可靠的WB实验方法了吗？科研人员为了简化WB实验的流程，一直在对其进行优化。近年，兴起了一种新的蛋白检测技术--全自动蛋白质表达定量分析（Automatic Quantitative Protein Analysis）。它将传统 WB 的制胶、蛋白电泳分离、杂交和成像集成到一个系统中，并实现全自动化。它因为步骤简单，也被叫做全自动毛细管Digital Western系统（也称Simple Western）。Digital Western一经问世，便深受科研人的喜爱，它不光节省样本，而且大大节省了操作时间，它精确的数据分析能力帮助科研人得到更准确的实验结果。顶级杂志Neuron（五年平均 IF = 18.65）2019 年发表的一篇文章中, Digital Western被用于微量中脑组织和原代神经元细胞蛋白质表达分析。作者仅用了 0.2μg总蛋白就得到实验结果，这只是传统WB所需蛋白量的几十分之一。Nature Communications（五年平均IF = 15.81）发表了一篇有关肿瘤细胞信号通路研究的论文，也用了Digital Western 系统来检测蛋白。在该系统中，所用抗体在正确的波段显示后才被正式使用到实验里。通过该系统自动化的数据分析，实验者对蛋白进行了有效定量，确定了每个样本中目标蛋白的绝对值，使实验结果更可信，更精准。图片来源：Nature Communications这些证据也许还不足以证明Digital Western的优势，利来·国际APP不免还是抱有怀疑：Digital Western真的有这么厉害吗？为此，有研究人员专门对比了Digital Western 系统和传统 WB 两种蛋白定量分析方法的灵敏度、重复性和适用范围[3]。结果表明相比于传统 WB ：➣ Digital Western 无需制胶、无需转膜，安全环保➣ 可以检测低至 0.5 μg 左右的蛋白量，对于来源不易的样本，更节省样品当目标蛋白分子量差异较大时，可以用Digital Western系统同时检测目标分子和内参。图注：采用Digital Western同时检测两种蛋白。(A) 同时检测内参（GAPDH 或 Actin）和目的蛋白Ku70的泳道图；(B) 同时检测GAPDH和目的蛋白 Ku70 的峰形图；(C) 同时检测Actin和目的蛋白Ku70的峰形图。其实，国内外目前已经有许多高分文献应用 Digital Western 技术检测蛋白，WB 正在经历着前所未有的技术革新。StellarTM 超灵敏荧光检测试剂盒，搭载在全自动多功能超灵敏荧光Western蛋白质分析平台Jess上（Digital Western），能为科研人提供自动化高灵敏荧光免疫蛋白检测技术解决方案。优势如下：图注：ProteinSimple超灵敏荧光检测试剂盒 StellarTM图注：Stellar NIR和IR荧光多重检测的AKT总/磷蛋白。StellarTM NIR / IR通道能够在同一泳道中多重检测总AKT和磷酸化AKT，并具有出色的重现性（24个泳道: pAKT < 10% CVs和Total AKT < 5% CVs）。图注：StellarTM 荧光检测的灵敏度通过DNA与检测抗体相连的多个信号放大步骤实现。➣ 简单高效对细胞信号通路研究中磷酸化蛋白进行检测➣ 全程追踪记录，原始数据不可纂改，解决传统 WB 图片误用造假问题➣ 与对照样品归一化处理，比使用内参蛋白更可靠，增加数据说服力[1]. Back S., Necarsulme J., Whitaker L.R., et al., Neuron-Specifific Genome Modifification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats. Neuron , 2019, 102: 105–119.[2]. Ilyas Chachoua, Ilias Tzelepis, Hao Dai, et al., Canonical WNT signaling-dependent gating of MYC requires a noncanonical CTCF function at a distal binding site. NATURE COMMUNICATIONS, 2022,13: 204.[3]. 雷虹, 胡峰瑞, 陈妍珂, 苟兴春. 蛋白免疫印迹和全自动蛋白质定量分析的比较研究[J]. 生物医学, 2021, 11(2): 113-119.
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